基因工程(建议用时：40分钟)1．(2020·赣州市高三模拟)滨藜在含盐量0.6%以上的条件下生长，是耐盐碱基因开发的理想材料。若将滨藜的耐盐碱基因转移到水稻等农作物体内，将会大大提高水稻等农作物的种植面积。回答下列问题：(1)从滨藜中获得耐盐碱基因需要用________酶处理，然后与含四环素抗性基因的Ti质粒连接构建________，并导入农杆菌。在含有四环素的固体培养基中培养，目的是___________________________________________________。(2)用农杆菌感染时，应优先选用水稻________(填“受伤的”或“完好的”)叶片与含重组质粒的农杆菌共同培养，选用这种叶片的理由是____________________________________。(3)导入耐盐碱基因的植株细胞经过________形成愈伤组织，然后________形成胚状体，继续发育形成转基因水稻幼苗。(4)将生长至4叶期的转基因幼苗转入高浓度的NaCl溶液(含盐量0.6%以上)中培养，进行耐盐实验，用非转基因幼苗作为对照。培养30天后观察两者的存活率差异。若__________________________________，则说明转基因植株获得了耐盐特性。[解析] (1)使用限制酶从滨藜中获得耐盐碱基因，与含抗生素抗性基因的Ti质粒连接构建基因表达载体(或重组质粒)，并导入农杆菌，将其在含有四环素的固体培养基中培养，目的是筛选出导入重组质粒的农杆菌。(2)当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，因此用农杆菌感染时，优先选用水稻受伤的叶片。(3)含有目的基因的植物细胞先脱分化形成愈伤组织，然后再分化形成根、芽和胚状体，然后继续发育形成转基因幼苗。(4)将生长至4叶期的转基因水稻幼苗转入含盐量0.6%以上的环境中培养，进行实验，用非转基因幼苗作为对照。若转基因植株存活率高于非转基因植株，说明转基因水稻植株获得了耐盐特性。[答案] (1)限制性核酸内切(或限制) 重组质粒(或重组DNA分子) 筛选出导入重组质粒的农杆菌 (2)受伤的 叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞 (3)脱分化 再分化 (4)转基因植株存活率高于非转基因植株2．(2020·全国卷Ⅲ)W是一种具有特定功能的人体蛋白质。某研究小组拟仿照制备乳腺生物反应器的研究思路，制备一种膀胱生物反应器来获得W，基本过程如图所示。回答下列问题：-9-\n(1)步骤①中需要使用的工具酶有________。步骤②和③所代表的操作分别是________和________。步骤④称为________。(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的________(答出2点即可)的限制。(3)一般来说，在同一动物个体中，乳腺上皮细胞与膀胱上皮细胞的细胞核中染色体DNA所含的遗传信息________(填“相同”或“不同”)，原因是________。(4)从上述流程可知，制备生物反应器涉及胚胎工程，胚胎工程中所用到的主要技术有________(答出2点即可)。[解析] (1)步骤①是基因表达载体的构建过程，该过程需要使用的工具酶有限制性核酸内切酶(限制酶)和DNA连接酶，用限制酶分别切割载体和目的基因，用DNA连接酶将目的基因和载体连接起来。步骤②和③所代表的操作分别是显微注射和体外培养。步骤④是将早期胚胎植入到代孕母体内，称为胚胎移植。(2)与乳腺生物反应器相比，用膀胱生物反应器生产W的优势在于不受转基因动物的性别和年龄的限制。(3)乳腺上皮细胞和膀胱上皮细胞都是体细胞。一般来说，在同一动物个体中，其体细胞都是由同一个受精卵分裂、分化而来的，细胞在分裂、分化过程中，其细胞核中染色体DNA所含的遗传信息一般是不变的，因此两种上皮细胞的染色体DNA所含的遗传信息相同。(4)据题述流程可知，胚胎工程中所用到的主要技术有体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植等。[答案] (1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶 显微注射 体外培养 胚胎移植 (2)性别、年龄 (3)相同 两种上皮细胞都是体细胞，且来源于同一个受精卵 (4)体外受精、胚胎移植3．(2020·张家口市高三模拟)MAP30蛋白是一种能使Ⅰ型核酸核糖体失活的蛋白质，存在于苦瓜果实和种子中。实验表明，MAP30蛋白具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等功能，近年来引起人们的广泛关注。现有一科研团队欲培育高效表达该蛋白基因的马铃薯新品种。请回答下列问题：(1)若要获取MAP30蛋白基因，人们可从________基因库中获得。获得目的基因后可利用PCR技术对其进行扩增，所用的缓冲液中除目的基因外，应包括________等物质。(2)构建基因表达载体时，需要使用到的酶是____________________________。为了避免出现“目的基因自我环化”“目的基因在运载体上反向连接”的问题，常用的解决办法是__________________________________________________。(3)将基因表达载体导入马铃薯受体细胞后，可用________技术得到转基因幼苗。检测MAP30蛋白基因是否在受体细胞中成功表达，可用___________________________________________________________________。(4)科研人员为了研究MAP30蛋白抗弧菌的效果，用含不同浓度MAP30蛋白培养液培养弧菌，绘制弧菌生长曲线如图：-9-\n由图可以得出的结论是____________________________________________________________________________________________________________。[解析] (1)获取目的基因，要从含有该基因的苦瓜基因库中寻找。利用PCR技术扩增该基因，PCR反应体系的主要成分应该包含4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、引物、热稳定DNA聚合酶、扩增缓冲液等。(2)构建基因表达载体需要使用到的酶是限制酶和DNA连接酶；为了避免出现“目的基因自我环化”“目的基因在运载体上反向连接”的问题，可分别使用两种限制酶去剪切目的基因和运载体。(3)可用植物组织培养技术得到转基因幼苗，可通过抗原—抗体杂交技术检测MAP30蛋白基因是否成功表达。(4)用含不同浓度MAP30蛋白培养液培养弧菌，根据图中曲线显示，随着MAP30蛋白浓度的升高，MAP30蛋白对弧菌生长的抑制作用增强；当MAP30蛋白浓度达到或高于500g/mL时，弧菌生长完全被抑制。[答案] (1)苦瓜 4种脱氧(核糖)核苷酸、引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶) (2)限制酶和DNA连接酶 分别使用两种限制酶去剪切目的基因和运载体 (3)植物组织培养 抗原—抗体杂交技术 (4)随着MAP30蛋白浓度的升高，MAP30蛋白对弧菌生长的抑制作用增强；当MAP30蛋白浓度达到或高于500g/mL时，弧菌生长完全被抑制4．(2020·福建省高三一模)人体内的tPA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的基因工程tPA会诱发颅内出血，其原因在于tPA与纤维蛋白结合的特异性不高。研究证实，将tPA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。据此，先对天然的tPA基因进行序列改造，然后再采取传统的基因工程方法表达该改造后的基因，可制造出性能优异的改良tPA蛋白。(注：如图表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY11为质粒，新霉素为抗生素。)-9-\n回答下列问题：(1)已知人tPA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA，而丝氨酸的密码子为UCU，因此改造后的基因决定第84位丝氨酸的模板链的碱基序列应设计为________。(2)若tPA改良基因的黏性末端如图所示，那么需选用限制酶________和__________切开质粒pCLY11，才能与tPA改良基因高效连接，在连接时需要用到________酶。(3)应选择________(填“能”或“不能”)在加入新霉素的培养基中生存并形成菌落的大肠杆菌作为受体细胞，目的是________________________。在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，需选择呈________色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良tPA蛋白的工程菌株。(4)以上制造性能优异的改良tPA蛋白的过程称为________工程。[解析] (1)根据碱基互补配对的原则，丝氨酸的密码子为UCU，则其编码序列为TCT，所以模板链的碱基序列为AGA。(2)若要质粒pCLY11与tPA突变基因高效连接，需质粒和突变基因切割后产生黏性末端能碱基互补配对，tPA突变基因切割后的黏性末端分别为－GGCC和－CTAG，故质粒pCLY11需要用XmaI和BglⅡ切割，连接时需要用DNA连接酶。(3)由于质粒上以新霉素抗性基因作为标记基因，所以选择不能在加入新霉素的培养基中生存并形成菌落的大肠杆菌作为受体细胞，以便筛选出导入质粒pCLY11的大肠杆菌。重组质粒的mlacZ序列被破坏，表达产物使细胞呈白色，故在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞需选择呈白色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良tPA蛋白的工程菌株。(4)通过对基因的改造实现对蛋白质的改造，称为蛋白质工程。[答案] (1)AGA (2)XmɑⅠ BglⅡ DNA连接 (3)不能 以便筛选出导入质粒pCLY11的大肠杆菌 白 (4)蛋白质5．(2020·淄博市高三二模)核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA片段)导入动物体细胞内，通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防或治疗相应疾病的一类新型疫苗。研究表明核酸疫苗不仅具有良好的免疫原性与安全性，且由于核酸更易于修饰与改造，较以往蛋白疫苗具有更大的灵活性和更广阔的应用前景。请回答：-9-\n(1)研发DNA疫苗时，构建含有病原体抗原基因表达载体的过程中需要用到的工具酶有____________________________。(2)图中所用的载体是________，构建基因表达载体的目的是______________________，基因表达载体中，驱动病原体抗原基因转录的结构________________。将该DNA疫苗导入受体细胞的方法是肌肉注射法或____________。(3)mRNA疫苗可以由计算机设计、制造并通过高速机器大批量生产。目前用于制造疫苗的RNA有两种，非复制型mRNA和自我扩增型mRNA，从图中可以看出自我扩增型mRNA的优点是可在细胞内____________________。mRNA常被包裹在脂质体颗粒中注射到相关人员的手臂肌肉，脂质体颗粒的作用是____________________________________。(4)病毒核酸检测试剂盒通常以病毒独特的基因序列为检测靶标。PCR扩增时每一个循环分为______________________三步，使靶标DNA序列呈指数增加。每一个扩增出来的DNA序列都与预先加入的一段荧光标记________结合，产生荧光信号，扩增出来的靶标DNA序列越多，累积的荧光信号就越强。在没有病毒的样本中，因为没有靶标DNA序列扩增，所以就检测不到荧光信号增强。[解析] (1)构建基因表达载体的过程中需要用到的工具酶有限制性核酸内切酶(限制酶)、DNA连接酶。(2)图中所用的质粒可以充当运载体的作用，构建基因表达载体可以使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体中的启动子可以驱动目的基因的转录。将该DNA疫苗导入受体细胞的方法是肌肉注射法或基因枪法。(3)从图中可以看出自我扩增型mRNA可在细胞内大量复制，提高蛋白质合成效率。mRNA常被包裹在脂质体颗粒中注射到相关人员的手臂肌肉，其中的脂质体颗粒可以保护mRNA，防止被酶降解。(4)PCR扩增时每一个循环分为变性、复性、延伸三步，使靶标DNA序列呈指数增加。每一个扩增出来的DNA序列都与预先加入的一段荧光标记探针结合，产生荧光信号，扩增出来的靶标DNA序列越多，累积的荧光信号就越强。-9-\n[答案] (1)限制性核酸内切酶(限制酶)、DNA连接酶 (2)质粒 使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用 启动子 基因枪法 (3)大量复制，提高蛋白质合成效率 保护mRNA，防止被酶降解 (4)变性、复性、延伸 探针6．(2020·潍坊市高三二模)我国是大豆的原产地，但目前我国大豆严重依赖进口。大豆细胞中与油脂合成相关酶的基因有DGAT2、FAD2、FAD3、KASⅠ、KASⅡ，它们通过控制多种酶的合成来控制油脂合成。采用基因工程育种能大幅度快速改良大豆品质。研究人员通过RACE技术获得转录因子WRI1，并将其在大豆中过量表达，结果显示转基因后代含油量比普通大豆提高8%以上，油酸和亚油酸的含量也显著提高了。(1)RACE技术(cDNA末端快速扩增技术)是一种基于PCR技术的，利用低丰度的转录本(由一个基因转录形成的一种或多种mRNA)快速扩增cDNA的有效方法，理论上通过此技术获取大量目的基因需经________和________两个基本过程。(2)在大豆内过量表达转录因子WRI1即可提高大豆含油量，表明WRI1基因在细胞内发挥的作用是________________________________。(3)质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)，对其进行酶切时应注意__________________________________________，以便筛选重组DNA。研究人员所选限制酶EoRV的酶切位点为…GAT↓ATC…，经其酶切后的片段还需经酶处理为________末端才能与目的基因连接。研究人员构建基因表达载体时往往使用产生后一种末端的限制酶，你认为这样做的理由是________________________________________________________________。(4)导入重组质粒的细胞还需经过________和________才能形成植株，在此过程中，____________________的协同调控作用非常重要。[解析] (1)cDNA是mRNA逆转录得到的，快速扩增cDNA，理论上需经逆转录和(DNA)复制两个基本过程。(2)大豆细胞中与油脂合成相关酶的基因有DGAT2、FAD2、FAD3、KASⅠ、KASⅡ，它们通过控制多种酶的合成来控制油脂合成。在大豆内过量表达转录因子WRI1即可提高大豆含油量，表明WRI1基因在细胞内发挥的作用是调控(增强)DGAT2、FAD2、FAD3、KASI、KASⅡ等基因的表达，促进油脂合成。(3)质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)，对其进行酶切时应注意所选限制酶的识别序列不能同时存在tetr和ampr中(不能同时酶切tetr和ampr)，否则标记基因都被破坏，无法进行后续重组DNA的筛选。研究人员所选限制酶EoR-9-\nV的酶切位点为…GAT↓ATC…，经其酶切后的片段还需经酶处理为黏性末端才能与目的基因连接(图示中目的基因含黏性末端)。相同黏性末端通过碱基互补能促进连接过程，加快反应速度(或DNA连接酶连接黏性末端的效率高于连接平末端)，因此研究人员构建基因表达载体时往往使用产生后一种末端(黏性末端)的限制酶。(4)导入重组质粒的细胞(分化的体细胞)还需经过脱分化(形成愈伤组织)和再分化(分化出相应的器官、组织)才能形成植株。在此过程中，生长素和细胞分裂素的协同调控作用非常重要。[答案] (1)逆转录 (DNA)复制 (2)调控(增强)DGAT2、FAD2、FAD3、KASI、KASⅡ等基因的表达，促进油脂合成 (3)所选限制酶的识别序列不能同时存在tetr和ampr中(不能同时酶切tetr和ampr) 黏性 相同黏性末端通过碱基互补能促进连接过程，加快反应速度(或DNA连接酶连接黏性末端的效率高于连接平末端) (4)脱分化 再分化 生长素和细胞分裂素7．实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq酶切断，在特定光激发下发出荧光(如图所示)，随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)。注：R表示荧光基因，Q表示淬灭基因(1)做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成________。除此之外，qPCR的反应体系还需要加入________、________和________。(2)在反应过程中，________为新链的合成提供能量。(3)医务人员对三位慢性粒细胞白血病患者(由B基因过量表达导致)进行治疗后，想检测治疗效果，利用上述技术写出实验思路和简要结果分析。实验思路：________________________；简要结果分析：_________________。[解析] (1)PCR需要根据目的基因的核苷酸序列合成引物，同时qPCR还需要Taqman探针与待测样本DNA混合，所以还需要合成Taqman探针；在反应体系中还需要添加待测样本(模板DNA)、dNTP、热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)。(2)在反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量。(3)根据题干信息“将标有荧光素的Taqman探针与待测样本DNA混合后，在变性、复性、延伸的热循环中，与待测样本DNA配对结合的Taqman探针被Taq-9-\n酶切断，在特定光激发下发出荧光，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关)”。所以设计实验思路：三位患者分别编号甲、乙、丙，分别抽取适量血样提取RNA，反转录得到cDNA，根据B基因的序列设计引物和探针，进行PCR扩增，检测荧光信号强度；结果：Ct值越小，说明治疗效果越好，反之，治疗效果越差。[答案] (1)引物和Taqman探针 待测样本(模板DNA) dNTP 热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)(2)dNTP (3)三位患者分别编号甲、乙、丙，分别抽取适量血样提取RNA，反转录得到cDNA，根据B基因的序列设计引物和探针，进行PCR扩增，检测荧光信号强度 三位患者检测的Ct值越小，说明治疗效果越好，反之，治疗效果越差8．(2020·德州市高三一模)荧光蛋白(GFP)在紫外光下会发出绿色荧光，某科研团队将GFP基因插入质粒P中构建了重组质粒载体P0，用于基因工程中基因表达载体(P1)的筛选和鉴定。部分过程如图所示，下表为部分限制酶的识别序列及切割位点。回答问题：(1)过程①中用EcoRⅤ酶切获得的目的基因具有________末端，过程②表示利用PCR技术扩增目的基因，前提是要根据________________设计出引物，此外还需在引物的一端加上________序列，以便于P1的构建和筛选。(2)过程③中，质粒P0需用限制酶________切割，才能与扩增出的目的基因在________酶作用下形成P1。(3)为了筛选出含有质粒P1的菌落，需采用添加________的培养基平板进行培养，在紫外光激发下________的菌落，即为含有P1的菌落。(4)提取经上述筛选所得菌落的RNA，通过________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出目的基因，可能的原因是_____________________。[解析] (1)从表格中看出用EcoRⅤ酶切获得的目的基因具有平末端；PCR扩增目的基因，需要根据一段已知目的基因的核苷酸序列设计出引物；构建P1时，限制酶Sau3AⅠ会破坏四环素抗性基因(标记基因)，所以只能选择BamHⅠ，还需要在引物的一端加上GATC序列。(2)根据(1)的分析，限制酶Sau3AⅠ会破坏四环素抗性基因(标记基因)，而EcoRⅤ酶破坏复制原点，所以需要选择BamHⅠ酶进行切割，切割后的目的基因在DNA连接酶的作用下形成P1-9-\n。(3)为了筛选含有质粒P1的菌落，由于标记基因是四环素抗性基因，所以需采用添加了四环素的培养基平板进行培养，在紫外光激发下，由于使用BamHⅠ酶破坏了GFP基因，所以选择不发出绿色荧光的菌落，即为含有P1的菌落。(4)所得菌落的RNA通过逆转录(反转录)获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出目的基因，可能的原因是目的基因未能在受体菌中转录。[答案] (1)平 一段已知目的基因的核苷酸序列 GATC (2)BamHⅠ DNA连接 (3)四环素 不发出绿色荧光 (4)逆转录(反转录) 目的基因未能在受体菌中转录-9-
