细胞工程(建议用时：40分钟)1．开放式光自养微繁技术是无糖与开放相结合的组培方法，即在无糖组培的容器中，在开放培养环境下，向培养基中加入广谱抑菌剂，省去严格的无菌操作，在提高组培效率的同时降低了生产成本，使更多植物实现组培产业化成为可能。回答下列问题：(1)植物离体的细胞可通过脱分化形成__________________，其在一定培养条件下可再分化出____________________，进而形成完整的植株，该过程实现的原理是____________________。(2)与传统植物组织培养相比，开放式光自养微繁技术改变培养基成分，培养基中不再含有糖，而是以__________________作为碳源。(3)自养微繁技术中也需要植物激素的作用，当生长素含量高于细胞分裂素时，利于________的分化；当细胞分裂素含量高于生长素时，利于________的分化。(4)与常规的种子繁殖方法相比，植物微型繁殖技术的特点有____________________________________________________________________(答出两点即可)。[解析] (1)根据植物组织培养过程可知，植物细胞在离体条件下可通过脱分化形成愈伤组织，然后经过再分化过程分化成幼根和芽，进而发育成完整个体。该过程主要依据的原理是植物细胞的全能性。(2)由于开放式光自养微繁技术是在开放培养环境下进行植物组织培养，植物可以进行光合作用，可以利用空气中的CO2作为碳源合成糖类等能源物质供植株利用，所以不需要在培养基中加入糖类等碳源。(3)植物组织培养技术在进行再分化培养时，培养基中生长素含量高于细胞分裂素时，利于植物根的分化；当细胞分裂素含量高于生长素时，利于植物芽的分化。利用培养基中激素比例的不同对细胞进行诱导分化，从而实现愈伤组织发育成完整植株的目的。(4)植物组织培养优点有很多，比如占用空间小，不受地区、季节限制；可以用来培养脱毒作物；培养周期短，可以加快育种过程；可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物；变异几率低，可保持原母本的一切遗传特性。[答案] (1)愈伤组织 幼根和芽 植物细胞的全能性 (2)CO2 (3)根 芽 (4)能保持植物原有的遗传特性、繁殖速度快2．下表表示高等动植物亲代个体产生新个体的3种不同途径，请据表分析并回答问题：生物途径主要流程动植物甲亲代个体→受精卵→胚→新个体植物乙亲代个体→体细胞→胚状体→新个体动物丙亲代个体→核移植细胞→早期胚胎→新个体-8-\n(1)甲、乙、丙途径中属于有性生殖的是________，三种途径中由胚(胚状体或早期胚胎)发育成新个体都需要经过细胞的________________。(2)相比于甲，乙、丙途径在应用上的优点是__________________。乙途径依据的原理是____________________________，动物一般采用丙途径而不采用乙途径繁殖新个体的原因是________________________________________。(3)丙途径中，从早期胚胎→新个体的流程中还需要进行的生物工程技术是____________________。该途径获得的新个体与供核的亲代个体性状不完全相同的原因是______________________________。(4)若从乙、丙途径获得的新个体中各取一小块组织进行体外培养。下列叙述错误的有________(填字母)。a．前者需先用盐酸解离，后者需先用胰蛋白酶处理b．前者培养基中一般加入蔗糖，后者一般加入葡萄糖c．前者培养过程需要持续光照，后者可在暗处培养d．两者培养过程中均需要保证无菌条件防止杂菌污染[解析] (1)甲表示动植物正常有性生殖的过程；乙表示植物组织培养产生新个体的过程，为无性繁殖；丙表示通过核移植产生新个体的方式，生殖方式为无性繁殖。三种途径中由胚(胚状体或早期胚胎)发育成新个体都需要经过细胞的分裂、分化才能完成新个体的发育过程。(2)相比于甲，乙、丙途径在应用上的优点是快速繁殖优良品种。乙途径为植物组织培养，该过程的原理是植物体细胞的全能性，由于高度分化的动物体细胞的全能性受到限制，分化潜能弱，故动物繁殖新个体一般采用丙途径。(3)丙途径中，从早期胚胎→新个体的流程中还需要进行的生物工程技术是胚胎移植。胚胎移植是动物细胞工程产生新个体的最后一步，该途径获得的新个体的遗传物质由供核的亲代的核基因和供质亲代的质基因共同组成，进而卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响，故新个体性状与供核亲本不完全相同。(4)植物组织离体后直接进行组织培养操作时，不需先用盐酸解离。后者为动物细胞需先用胰蛋白酶处理，分散成单个细胞再进行培养，a错误；前者培养过程为植物组织培养，培养基中一般加入蔗糖，后者为动物细胞培养，培养液中一般加入葡萄糖，b正确；前者为植物组织培养，前期不需要光，后期需要持续光照，后者为动物细胞培养可在适宜条件下培养，c错误；两者培养过程中均需要保证无菌条件，这是实验成功的关键，d正确。[答案] (1)甲 分裂和分化(或分裂、分化、衰老、凋亡等过程) (2)快速繁殖优良品种 植物体细胞的全能性 高度分化的动物体细胞的全能性受到限制，分化潜能弱 (3)胚胎移植 卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响 (4)ac-8-\n3．(2020·河北省石家庄市高三质检)随着动物细胞工程技术的不断成熟，使通过核移植技术诱导重组体细胞增殖分化获得健康的组织器官成为了可能，这为等待器官移植的非遗传病患者带来了希望。如图为通过该技术获得相应组织器官并进行移植的过程，请回答下列问题：(1)图中的供体二为________(填“患者”或“健康者”)，细胞①应为________细胞。(2)②为重组细胞，其经过A________(技术手段)形成囊胚，其中④细胞在形态上具有________特征。(3)B过程需要在培养基中加入________才能获得相应的组织器官。图中B→C过程________(填“能”或“不能”)体现细胞的全能性，其理由是__________________________________________________。(4)研究表明：已痊愈的新型肺炎患者体内会出现相应抗体，一般抗体的作用会持续半年或者更长时间。若现已从某位志愿者体内获得一定量的B淋巴细胞，实验室有保存的小鼠骨髓瘤细胞，为获得产生相应抗体的杂交瘤细胞，请写出关键过程_________________________________________________________。[解析] (1)由分析可知，图中的供体二为患者，细胞①应为健康者提供的(正常的)卵母细胞。(2)②为重组细胞，其经过A早期胚胎培养形成囊胚，其中④胚胎干细胞在形态上表现为细胞体积小、细胞核大、核仁明显的特征。(3)由于胚胎干细胞需经诱导分化形成相应的组织器官，所以B过程需要在培养基中加入分化诱导因子才能获得相应的组织器官。图中B→C过程不能体现细胞的全能性，其理由是该过程仅形成组织器官，没有形成完整个体。(4)若现已从某位志愿者体内获得一定量的B淋巴细胞，实验室有保存的小鼠骨髓瘤细胞，为获得产生相应抗体的杂交瘤细胞的关键过程为将获得的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，从融合的产物中分离筛选杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞中筛选出产生相应抗体的杂交瘤细胞[答案] (1)患者 (正常的)卵母细胞 (2)早期胚胎培养 细胞体积小、细胞核大、核仁明显 (3)分化诱导因子 不能 该过程仅形成组织器官，没有形成完整个体 (4)将获得的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，从融合的产物中分离筛选杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞中筛选出产生相应抗体的杂交瘤细胞4．近期，5只生物钟紊乱的体细胞克隆猴登上中国综合英文期刊《国家科学评论》封面，标志着中国体细胞克隆技术走向成熟。如图为克隆猴的步骤，请回答下列问题：-8-\n(1)在各级神经中枢中，与猴子生物节律控制有关的中枢位于________。除了脑部主生物钟外，在肝脏、胰脏等器官中还存在局部生物钟，敲除猴子肝脏细胞中的生物钟基因后，出现低血糖症状，其原因可能是________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)核移植前需将A猴卵母细胞培养至______________期，并进行去核操作，其目的是____________________________________________。从细胞水平分析，与取B猴体细胞的细胞核进行移植相比，直接将B猴体细胞注入去核A猴卵母细胞的优势是__________________________________。(3)重组细胞进行体外培养，需要气体环境和无菌、无毒的环境，其中前者需要的气体主要是________；后者的具体操作有_____________________(答三点)。[解析] (1)与生物节律控制有关的中枢位于下丘脑。在肝脏、胰脏等器官中还存在局部生物钟，敲除猴子肝脏细胞中的生物钟基因后，出现低血糖症状，其原因可能是肝脏细胞中的肝糖原分解产生葡萄糖并进入血液中，受生物钟基因调控。(2)核移植前需将A猴卵母细胞培养至减数第二次分裂中期，并进行去核操作，其目的是保证克隆猴的遗传物质主要来自B猴。从细胞水平分析，与取B猴体细胞的细胞核进行移植相比，直接将B猴体细胞注入去核A猴卵母细胞可以避免取核过程对核造成损伤。(3)重组细胞进行体外培养，需要的气体环境主要是O2和CO2；保证无菌无毒环境的具体操作有对培养皿和所有培养用具进行无菌处理；在培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液。[答案] (1)下丘脑 肝脏细胞中的肝糖原分解产生葡萄糖并进入血液中，受生物钟基因调控 (2)减数第二次分裂中 保证克隆猴的遗传物质主要来自B猴 避免取核过程对核造成损伤 (3)O2和CO2 对培养皿和所有培养用具进行无菌处理；在培养液中添加一定量的抗生素；定期更换培养液5．(2020·潍坊市一中高三模拟)科研人员在杂交瘤细胞的基础上，获得了双杂交瘤细胞，能够产生双特异性抗体，该抗体可以同时结合两种抗原。(1)科研人员将抗原α、β分别注射到小鼠体内，引起机体的________免疫，________分泌相应抗体。(2)科研人员获得上述小鼠的脾脏细胞，制备两种杂交瘤细胞。每种杂交瘤细胞产生的抗体结构、与抗原结合的情况如图1所示。-8-\n图1 图2①制备杂交瘤细胞时，需将上述小鼠的脾脏组织，用________处理获得单细胞后，再与小鼠的骨髓瘤细胞融合，筛选得到两种杂交瘤细胞。将两种杂交瘤细胞用________试剂处理促进其融合，在培养基中加入________(天然成分)培养。如果两种细胞成功融合，则会同时表达出抗体的重链A、B和轻链a、b，这种细胞称作双杂交瘤细胞。②抗体由两条重链和两条轻链组成，重链和轻链均分为恒定区和可变区，两条重链依赖于A1或B1进行组装(A1与B1相同)，重链与轻链的组装依赖于恒定区A2、a或B2、b(a与b相同)。因此，双杂交瘤细胞产生的抗体种类较多，其中有一种抗体能同时与抗原α、β结合称为双特异性抗体，如图2。请将A1、A2、B1、B2、a、b、α、β等字符填入下面的表格中。123456A2B2α③为使双杂交瘤细胞只产生图2所示双特异性抗体，降低纯化分离成本，科研人员对重链、轻链的结构进行改造。改造思路是在A、B、a、b的恒定区通过改变________，进而改变蛋白质的空间结构，实现“榫卯”式互补组装的唯一性，这种改造属于现代生物技术中的________工程。(3)结合双特异性抗体特点，请分析其在肿瘤治疗方面的应用前景：__________________________________________________________________。[解析] (1)抗原进入小鼠体内能够引起机体的体液免疫，使浆细胞分泌抗体。(2)①制备杂交瘤细胞，将小鼠的脾脏组织用胰蛋白酶处理获得单细胞。动物细胞的融合需要使用PEG进行诱导，再加入动物血清进行培养。②双抗体是同时含有与抗原α、β结合的抗体。由于1是A2，根据图1的结构3为a,2是B2,4是b,5是α，6是β。即答案为：123456A2B2abαβ③蛋白质的空间结构是由氨基酸的种类和排列顺序决定，所以可以通过改变氨基酸的种类和排列顺序改变蛋白质的空间结构，属于蛋白质工程。(3)双抗体可以和两种抗原结合，所以可以研制与肿瘤细胞和抗肿瘤药物结合的双特异性抗体，特异性杀死肿瘤细胞。[答案] (1)体液 浆细胞 (2)①胰蛋白酶 PEG(或“聚乙二醇”) 动物血清②123456-8-\nA2B2abαβ③氨基酸种类(或“序列”) 蛋白质 (3)研制与肿瘤细胞和抗肿瘤药物结合的双特异性抗体，特异性杀死肿瘤细胞6．(2020·广东省六校联盟高三联考)2019年中国科学院神经科学研究所利用CRISPR—Cas9基因编辑技术，成功构建了世界首例核心节律基因BMAL1敲除猕猴模型，并成功用基因敲除猴的体细胞通过克隆技术培育了5只克隆疾病猴，为节律紊乱相关疾病机理的研究提供了比较理想的动物模型。CRISPR—Cas9基因编辑系统由单链向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白组成。回答下列问题：(1)科学家常用________法将CRISPR—Cas9基因编辑系统导入猕猴细胞，编辑系统利用sgRNA来识别靶基因DNA，并引导Cas9蛋白剪切DNA，使靶基因发生改变，实现基因敲除。sgRNA能识别靶基因DNA的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)在体外培养猕猴体细胞时，需要一定比例的O2和CO2，故通常采用________或____________________________(填实验器材)，将其置于CO2培养箱中进行培养。所使用的培养基属于________(填“合成”或“天然”)培养基，培养基除了灭菌外，还需要通过______________________________来保证无菌无毒环境。(3)进行体细胞克隆选择去核卵母细胞作为受体细胞，可能原因是___________________________________________________________________(答出两点)。(4)克隆猴被用于人类疾病研究与治疗中所具有的突出优点是__________________________。[解析] (1)将目的基因注入动物细胞常用显微注射，sgRNA本质是RNA，基因DNA本质是DNA分子，都是由核苷酸组成的长链，遵循碱基互补配对原则，所以二者能够识别的原因是sgRNA的碱基序列能与靶DNA的碱基序列发生互补结合。(2)动物细胞培养可以在培养皿和松盖培养瓶中进行，将其置于CO2培养箱中进行培养。所使用的培养基需要明确各种化学成分，所以是合成培养基，培养基需要添加一定量的抗生素(可以杀菌)并定期更换培养液来保证无菌无毒环境。(3)去核卵母细胞的体积较大，易于进行实验操作；含有较多的营养物质，可以满足早期胚胎发育的需要；含有使已经分化的细胞核恢复分裂能力的物质，因此进行体细胞克隆时，可以作为受体细胞。(4)猴子与人的亲缘关系近；克隆动物能减少个体差异的影响，所以克隆猴被用于人类疾病研究与治疗。[答案] (1)显微注射 sgRNA的碱基序列能与靶DNA的碱基序列发生互补结合 (2)培养皿 松盖培养瓶 合成 添加一定量的抗生素并定期更换培养液 (3)去核卵母细胞的体积较大，易于进行实验操作；含有较多的营养物质，可以满足早期胚胎发育的需要；含有使已经分化的细胞核恢复分裂能力的物质 (4)亲缘关系近；克隆动物能减少个体差异的影响-8-\n7．科研人员采用转基因体细胞克隆技术获得转基因绵羊，以便通过乳腺生物反应器生产人凝血因子IX医用蛋白，其技术路线如图。(1)要想目的基因只在乳腺组织中表达，在构建基因表达载体A时，需要将________基因和________________等调控组件重组在一起。(2)将A导入绵羊胎儿成纤维细胞中常用的方法是____________。将A导入受精卵能否获得转基因绵羊？________，判断依据是___________________________________________________________。(3)核移植的受体应选用________期卵母细胞。(4)移植应选择胚胎发育到________阶段时进行；转基因绵羊的性状基本上与代孕母羊无关的原因是___________________________________________。[解析] (1)①过程构建的A是含目的基因的(基因)表达载体。它必须将目的基因人凝血因子IX与乳(腺)蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，才能通过分泌乳汁来生产人凝血因子IX医用蛋白。(2)将A导入绵羊胎儿成纤维细胞中常用的方法是显微注射法。因为受精卵具有发育的全能性，将受精卵体外培养成早期胚胎再胚胎移植就可获得转基因绵羊。(3)在核移植之前，必须先去掉受体卵细胞的核，目的是保证核遗传物质来自含目的基因的成纤维细胞，核移植的受体应选用处于MⅡ中期的卵母细胞。(4)移植应选择胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段时进行；转基因绵羊的细胞核来源于供核母羊，因此转基因绵羊的性状与供核母羊最相似，基本上与代孕母羊无关。[答案] (1)人凝血因子IX 乳腺组织特异性表达的启动子 (2)显微注射法 能 因为受精卵具有发育的全能性，将受精卵体外培养成早期胚胎再胚胎移植就可获得转基因绵羊 (3)MⅡ中 (4)桑椹胚或囊胚 胚胎的遗传性状基本不受受体的任何影响8．EV71是引发手足口病的一种人肠道病毒。为制备抗EV71的单克隆抗体，科研人员用小鼠进行实验。(1)将EV71灭活病毒、EV71外壳蛋白VP1和VP2作为________分别注射到3组小鼠体内，引发小鼠机体的________免疫，产生相应的抗体。(2)多次免疫后，分别取上述3组小鼠的血清和未免疫小鼠血清，测定抗体与抗原的结合强度，结果如图所示。-8-\n抗原种类①EV71免疫的小鼠血清抗体________(填“是”或“不是”)单一抗体，判断依据是________________________________________________。②测定各组小鼠血清与非EV71蛋白结合强度，目的是排除______________________的影响。③制备抗EV71单克隆抗体时，选用________免疫的小鼠脾脏细胞效果最佳，依据是________________________________________________________。(3)取相应免疫组小鼠的脾脏，剪碎并用________酶处理得到小鼠脾脏细胞，用灭活的病毒诱导，与________细胞融合，筛选获得5个不同的杂交瘤细胞株。(4)为进一步研究抗体的作用效果，科研人员培养上述杂交瘤细胞株，获得5种单克隆抗体，分别将它们与等量EV71混合，加入到5组RD细胞(EV71的宿主细胞)中，测定________，以分析抗体的作用效果。[解析] (1)将EV71灭活病毒、EV71外壳蛋白VP1和VP2作为抗原，分别注射到3组小鼠体内，引发小鼠机体的体液免疫，产生相应的抗体。(2)①EV71免疫的小鼠血清抗体不是单一抗体，判断依据是EV71免疫的小鼠血清可以结合EV71、VP1和VP2多种抗原。②测定各组小鼠血清与非EV71蛋白结合强度，目的是排除抗体与其他蛋白的非特异性结合对实验结果的影响。③制备抗EV71单克隆抗体时，选用VP1免疫的小鼠脾脏细胞效果最佳，依据是第2组血清抗体可以结合EV71病毒(和VP1蛋白)，第3组血清抗体无法特异性结合EV71病毒，仅能结合VP2。(3)取相应免疫组小鼠的脾脏，剪碎并用胰蛋白酶处理得到小鼠脾脏细胞，用灭活的病毒诱导，与骨髓瘤细胞融合，筛选获得5个不同的杂交瘤细胞株。(4)为进一步研究抗体的作用效果，科研人员培养上述杂交瘤细胞株，获得5种单克隆抗体，分别将它们与等量EV71混合，加入到5组RD细胞(EV71的宿主细胞)中，测定RD细胞被EV71的感染率，以分析抗体的作用效果。[答案] (1)抗原 体液 (2)①不是 EV71免疫的小鼠血清可以结合EV71、VP1和VP2多种抗原 ②抗体与其他蛋白的非特异性结合对实验结果 ③VP1 第2组血清抗体可以结合EV71病毒(和VP1蛋白)，第3组血清抗体无法特异性结合EV71病毒，仅能结合VP2 (3)胰蛋白 骨髓瘤 (4)RD细胞对EV71的感染率-8-
