第1讲 基因工程李仕才考纲要求全国卷五年考情1.基因工程的诞生(Ⅰ)2022·卷ⅠT382.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)2022·卷ⅠT38,2022·卷ⅡT38,2022·卷ⅢT38,2022·卷ⅢT402022·卷ⅠT40,2022·卷ⅠT40,2022·卷ⅡT40,2022·卷ⅡT402022·卷ⅠT403.基因工程的应用(Ⅱ)2022·卷ⅠT38,2022·卷ⅡT38,2022·卷ⅡT404.蛋白质工程(Ⅰ)2022·卷ⅡT40,2022·卷ⅠT40考点一|基因工程的基本工具(对应学生用书第245页)[识记—基础梳理]1．基因工程的概念及优点(1)概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。(2)优点①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。2．基因工程的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并切开特定两个核苷酸之间的磷酸二酯键。③结果：产生黏性末端或平末端。已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在下图中写出这两种限制酶切割DNA后产生的末端种类。20\n(2)DNA连接酶(3)载体①常用载体：质粒，其化学本质是独立于拟核之外的双链环状DNA分子。②其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。③特点及意义：特 点意 义稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择[教材边角知识] 选修3 P6“寻根问底”,DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。_________________________________________________________________【提示】 不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。[理解—深化探究]1．基因工程技术使用限制酶需注意哪些问题？【提示】 ①获取目的基因和切割载体时，经常使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶)，目的是产生相同的黏性末端或平末端。②获取一个目的基因需限制酶切割两次，共产生4个黏性末端或平末端。③限制酶切割位点的选择，必须保证标记基因的完整性，以便于检测。④为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。2．限制酶和DNA连接酶的关系(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(3)DNA连接酶起作用时，不需要模板。[运用—考向对练]考向 考查基因工程的基本工具的作用20\n如图所示为pBR322质粒，其中ampr(氨苄青霉素抗性基因)和tetr(四环素抗性基因)为标记基因，ori为复制原点，其他均为限制酶及其识别位点，并且每种限制酶都只有一个。pBR322质粒是基因工程较常用的运载体。回答下列相关问题：(1)制备重组质粒，需要限制酶和_____酶。如制备重组质粒时，使用PvuⅠ切割该质粒，则检测目的基因是否导入受体细胞，需要在培养基中添加_______。(2)该质粒中的BamHⅠ识别的核苷酸序列及切割位点为，而Sau3AⅠ识别的核苷酸序列只有4个碱基。若BamHⅠ和Sau3AⅠ分别切割DNA所形成的DNA片段能拼接成一条DNA链，则Sau3AⅠ识别的核苷酸序列及切割位点为________。该拼接在一起的DNA片段，能否被BamHⅠ识别？________。(3)与图示质粒相比，完整的重组质粒中还应有________________________等三种特殊的DNA片段。将重组质粒导入动、植物细胞的方法分别为________，如受体细胞为大肠杆菌，则该菌经钙离子处理后，将具备________________的特性。[解析] (1)基因工程所用的工具酶是限制酶和DNA连接酶。使用PvuⅠ切割pBR322质粒会破坏ampr(氨苄青霉素抗性基因)，而tetr(四环素抗性基因)，不受破坏所以可用含有四环素的培养基来筛选具有目的基因的细胞。(2)综合设问信息，可推知Sau3AⅠ识别的核苷酸序列及其切割位点为，这样Sau3AⅠ和BamHⅠ切割DNA时才能形成相同的黏性末端，进而能被拼接成一条DNA链。重新拼接点的核苷酸序列不一定是GGATCC，因此不一定能被BamHⅠ识别，但一定能被Sau3AⅠ识别。(3)一个完整的重组质粒有标记基因、目的基因、启动子、终止子和复制原点等特殊片段。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，而导入动物细胞的方法有显微注射法。钙离子处理后的大肠杆菌，将处于感受态，该状态的细胞具有将外界DNA吸入细胞的特性。[答案] (1)DNA连接 四环素 (2)20\n 不一定能 (3)启动子、终止子和目的基因 显微注射法，农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法(后者答出一个即可) 将外界DNA吸入细胞比较项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键形成产物有黏性末端或平末端的DNA片段形成重组DNA分子新的DNA分子形成单链DNA 根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：AATTC……G G……CTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必须具有的特点是__________。(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。(4)反转录作用的模板是________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。(5)基因工程中除质粒外，________和________也可作为运载体。(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_____________________________________________________________________________________________________________。[解析] 限制性核酸内切酶切割DNA分子形成的末端通常有两种，即黏性末端和平末端。为使运载体和目的基因连接，二者必须具有相同的黏性末端，因而当使用除EcoRⅠ之外的其他酶进行切割时，应该产生相同的黏性末端。DNA连接酶的来源有两个：一是大肠杆菌，二是T4噬菌体。反转录是由RNA形成DNA的过程，获得大量反转录产物时常用PCR扩增技术。基因工程常用的运载体是质粒，除此以外，噬菌体和动植物病毒也可作为运载体。如果用大肠杆菌作受体细胞，必须用钙离子处理，使其处于感受态(此状态吸收外源DNA的能力增强)。[答案] (1)黏性末端 平末端 (2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同 (3)大肠杆菌 T420\n (4)mRNA(或RNA) cDNA(或DNA) PCR (5)噬菌体 动植物病毒 (6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱考点二|基因工程的基本操作程序及应用(对应学生用书第246页)[识记—基础梳理]1．基因工程的基本操作程序(1)目的基因的获取①目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。②方法(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。②基因表达载体的组成③构建过程(3)将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射法感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵微生物细胞或酵母菌转化过程将目的基因插入Ti质粒的TDNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNACa2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子20\n上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物(4)目的基因的检测与鉴定方法检测或鉴定目的水平DNA分子杂交技术检测目的基因的有无分子水平分子杂交技术目的基因是否转录抗原－抗体杂交目的基因是否翻译抗虫或抗病接种实验是否具有抗虫抗病特性个体水平2．PCR技术(1)原理：DNA双链复制。(2)条件(3)过程过程说明图解变性当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链复性温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸72℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸(4)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。3．基因工程的应用(1)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物、抗逆转基因植物、利用转基因改良植物的品质。(2)动物基因工程：①提高动物生长速度、改善畜产品的品质、用转基因动物生产药物、用转基因动物作器官移植的供体。②乳腺生物反应器：药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起。(3)基因工程药品：①受体细胞：多为原核细胞。原因是其繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。②成果：生产出细胞因子、抗体、疫苗、激素等。20\n(4)基因治疗：①方法：基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。②类型：体内基因治疗和体外基因治疗。[理解—深化探究]1．基因组文库和部分基因文库是如何构建的？【提示】 基因组文库的构建过程为：某种生物全部DNA许多DNA片段受体菌群体。部分基因文库的构建过程为：某种生物发育的某个时期的mRNAcDNA受体菌群体。2．简述基因工程操作四步曲中哪些步骤存在碱基互补配对现象？【提示】 第一步用PCR或人工合成法获取目的基因时存在碱基互补配对，第二步构建基因表达载体黏性末端连接时存在碱基互补配对，第四步目的基因的检测与鉴定步骤中分子杂交及基因表达时存在碱基互补配对。3．辨析乳腺生物反应器与工程菌生产药物比较项目乳腺生物反应器工程菌基因结构动物基因的结构与人类基因的结构基本相同细菌和酵母菌等生物基因的结构与人类基因的结构有较大差异基因表达合成的药物蛋白与天然蛋白质相同细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，产生的药物蛋白可能没有活性受体细胞动物的受精卵微生物细胞导入目的基因的方式显微注射法感受态细胞法生产条件不需严格灭菌，温度等外界条件对其影响不大需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、pH、营养物质浓度等外界条件药物提取从动物乳汁中提取从微生物细胞中提取[运用—考向对练]考向1 基因工程的原理及应用1．(2022·济宁市高三一模)干旱会影响农作物产量，科学家们对此进行了研究。下图为用探针检验某一抗旱植物基因型的原理，相关基因用R和r表示20\n(1)在利用PCR技术扩增R或r基因的过程中，利用________可寻找抗旱基因的位置并进行扩增。(2)若被检植株发生A现象，不发生B、C现象。据此推测检测另一抗旱植物时会发生________(填“A”“B”或“A或B”)现象。(3)用从基因文库中获取目的基因的方法获取抗旱基因时需要用到限制酶，限制酶能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的____________断开。(4)经检测，抗旱基因已经导入到烟草细胞，但未检测出抗旱基因转录出的mRNA，从构建基因表达载体的角度推测，最可能的原因是______________________________________________________________________________。(5)要快速繁殖转基因抗旱烟草植株，目前常用的技术是____________，该技术的基本过程是：将离体的烟草细胞诱导脱分化形成________，然后再分化出根和芽并发育成小植株。该技术在作物新品种的培育方面两个最主要的应用是：突变体的利用和____________________________________________。[解析] (1)用PCR技术扩增R或r基因时，需要用引物寻找抗旱基因的位置。(2)被检植物发生A现象，不发生B、C现象，即r探针没有形成杂交环，所以被检植物的基因型为RR。因此另一抗旱植物的基因型为RR或Rr，据图分析可发生A或B现象。(3)限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。(4)经检测，抗旱基因已经导入到烟草细胞，但未检测出抗旱基因转录出的mRNA，从构建基因表达载体的角度推测，最可能的原因是基因表达载体上目的基因首端未加入启动子。(5)植物组织培养技术可快速繁殖抗旱烟草植株，该技术包括脱分化和再分化两个基本过程，其中先将离体的烟草细胞诱导脱分化形成愈伤组织，然后再分化出根和芽并发育成小植株。该技术在作物新品种的培育方面两个最主要的应用是：突变体的利用和单倍体育种。[答案] (1)引物 (2)A或B (3)磷酸二酯键 (4)基因表达载体上目的基因首端未加入启动子 (5)植物组织培养 愈伤组织 单倍体育种2．(2022·昆明市高三摸底调研)科学家将拟南芥的抗寒基因(CBFl)，转入香蕉以获得抗寒的香蕉品种。如图是某质粒载体上的SacⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ四种限制酶的切割位点示意图。【导学号：67110093】20\n据图回答问题：(1)在该实验中为构建基因表达载体，用SacⅠ、XbaⅠ切下CBFl基因后，对质粒载体进行切割的限制酶是________，理由是____________________。(2)连接CBFl基因到该质粒载体后，作为基因表达载体的组成还必须有________________。将重组质粒导入香蕉细胞最常用的方法是__________。(3)为了鉴别受体细胞中是否含有CBFl基因，可用含________的培养基进行筛选。(4)科学家将生长健壮、苗龄一致的转基因香蕉(实验组)与非转基因香蕉(对照组)进行________处理，鉴定两组之间的抗寒性差异，如果________________，则说明获得了抗寒的香蕉优质品种。[解析] (1)在基因工程中，用相同限制酶切割来源不同的DNA后，可产生相同的末端，所以和含目的基因的DNA一样，质粒也应使用SacⅠ、XbaⅠ进行切割。(2)基因表达载体的组成包括启动子、终止子、标记基因、目的基因等。香蕉细胞是植物细胞，将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。(3)据图分析，质粒上的标记基因是氨苄青霉素抗性基因，所以为了鉴别受体细胞中是否含有CBFl基因，可用含氨苄青霉素的培养基进行筛选。(4)根据题干信息已知目的基因是抗寒基因，所以科学家将生长健壮、苗龄一致的转基因香蕉(实验组)与非转基因香蕉(对照组)进行低温处理，鉴定两组之间的抗寒性差异，如果实验组的抗寒能力明显高于对照组，则说明获得了抗寒的香蕉优质品种。[答案] (1)SacⅠ、XbaⅠ 用相同限制酶切割来源不同的DNA后，可产生相同的末端(2)启动子和终止子 农杆菌转化法(3)氨苄青霉素(4)低温 实验组的抗寒能力明显高于对照组 下图是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。据图回答：20\n(1)获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在________酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在__________的作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的________序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的________序列，再通过化学方法合成所需基因。(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有________、________、4种脱氧核糖核苷三磷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。(3)由A和载体B拼接形成的C通常称为________。(4)在基因工程中，常用Ca2＋处理D，其目的是________________________。[解析] (1)利用逆转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶作用下，合成双链DNA分子；根据蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。(2)PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。(3)目的基因和运载体结合，形成重组DNA(基因表达载体)。(4)在利用大肠杆菌做受体细胞时，需要先用Ca2＋处理，使之成为感受态细胞，有利于其吸收重组DNA分子。[答案] (1)逆转录 DNA聚合酶 氨基酸 脱氧核苷酸(2)引物 模板DNA(重组载体或基因表达载体)(3)重组DNA(4)提高受体细胞的转化率考向2 与其他生物工程技术的综合考查3．(2022·潍坊市高三一模)如图表示中国科研人员对树鼩精原干细胞进行遗传修饰后，通过自然交配获得世界首只转基因树鼩的过程。请回答下列问题：(1)培养精原干细胞时，定期更换培养液的目的是防止______________对自身细胞代谢造成障碍，通入二氧化碳的作用是_________________________。(2)图中涉及的基因工程的核心步骤是__________________，通常采用________技术将GFP基因导入树鼩精原干细胞。(3)利用PCR技术扩增GFP基因需要________酶，外源的GFP基因能在树鼩体内表达的原因是__________________________。(4)图示过程与通过体外受精培育转基因动物相比，避免了将受精卵移入________中继续培养的麻烦，同时也克服了胚胎发育到________时期进行胚胎移植的难题。[解析] (1)根据动物细胞培养过程中的条件可知，定期更换培养液的目的是防止细胞代谢产物的积累对自身细胞代谢造成障碍，通入二氧化碳的作用是维持培养液的pH。20\n(2)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，将目的基因导入动物细胞一般采用显微注射技术。(3)PCR技术的原理是DNA的双链复制，利用PCR技术扩增GFP基因需要DNA聚合酶，外源的GFP基因能在树鼩体内表达的原因是所有生物共用一套遗传密码。(4)图示过程与通过体外受精培育转基因动物相比，避免了将受精卵移入发育培养液中继续培养的麻烦，同时也克服了胚胎发育到囊胚、桑椹胚时期进行胚胎移植的难题。[答案] (1)细胞代谢产物的积累 维持培养液的pH (2)基因表达载体的构建 显微注射 (3)DNA聚合 所有生物共用一套遗传密码 (4)发育培养液 囊胚、桑椹胚 下列方案为人们获得生物新品种的过程，请回答下列问题：方案Ⅰ：抗冻蛋白基因烟草细胞―→抗冻烟草方案Ⅱ：A基因免疫过的B细胞―→体外培养―→单克隆抗体方案Ⅲ：人的生长激素基因牛的受精卵―→早期胚胎受体母牛―→转基因牛(1)基因工程的核心步骤是____________。农杆菌转化法中，根据农杆菌的特点，如果将抗冻蛋白基因插入____________上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入植物细胞中____________上。(2)推测方案Ⅱ中A基因所起的作用是____________，请写出该方案获得的细胞中遗传信息传递时所遵循的法则____________。(3)方案Ⅲ中的转基因牛可以通过分泌乳汁来生产人的生长激素。这需要将人的生长激素基因与____________的启动子等调控组件重组在一起。该方案中的早期胚胎在移植入受体母牛子宫之前，必须进行性别鉴定，一般是取处于____________时期的____________细胞进行检测。[解析] (1)基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤。农杆菌转化法中，将抗冻蛋白基因插入Ti质粒的TDNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因插入植物细胞中染色体DNA上。(2)方案Ⅱ中将A基因导入免疫过的B淋巴细胞生产单克隆抗体，说明A基因使得细胞无限增殖，即A基因能够调控细胞无限增殖，该基因在受体细胞中能够复制、转录和翻译。(3)方案Ⅲ中将人的生长激素基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，使得转基因牛可以通过分泌乳汁来生产人的生长激素。囊胚中的内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，滋养层细胞发育成胎盘和胎膜，将早期胚胎移植入受体母牛子宫之前，一般取处于囊胚时期的滋养层细胞进行性别检测。[答案] (1)基因表达载体的构建 Ti质粒的TDNA 染色体DNA(2)调控细胞无限增殖20\n(3)乳腺蛋白基因 囊胚 滋养层考点三|蛋白质工程(对应学生用书第249页)[识记—基础梳理]1．蛋白质工程(1)概念以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。(2)流程图写出流程图中字母代表的含义：A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。2．蛋白质工程与基因工程的比较(1)区别项目蛋白质工程基因工程过程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质(2)联系①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。[运用—考向对练]考向 考查蛋白质的原理及应用(2022·邯郸市高三二模)科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率，请回答下列问题：20\n(1)PCR过程所依据的原理是________，该过程需要加入的酶是________。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成________。(2)该技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造，其原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________。和传统基因工程技术相比较，定点突变最突出的优点是_______________________________________________________________，PCR定点突变技术属于____________的范畴。(3)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体。常用________将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是_______________________________________________。[解析] (1)PCR的原理是DNA双链复制；利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物；扩增过程是在较高温度下进行的，因此需要加入耐高温的DNA聚合酶(或Taq酶)。(2)蛋白质空间结构较为复杂，改造困难。直接改造蛋白质不能遗传，改造了的基因能遗传，因此蛋白质工程技术不直接改造Rubisco酶，而通过对Rubisco酶基因进行改造，从而实现对Rubisco酶的改造。和传统基因工程技术相比较，定点突变技术最突出的优点是能生产出自然界不存在的蛋白质，因此PCR定点突变技术属于蛋白质工程的范畴。(3)将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；将转基因植物细胞培育成转基因植株还需要采用植物组织培养技术，原理是植物细胞具有全能性。[答案] (1)DNA双链复制 耐高温的DNA聚合酶(或Taq酶) 引物 (2)蛋白质空间结构较为复杂，改造困难；直接改造蛋白质不能遗传，改造了的基因能遗传 能生产出自然界不存在的蛋白质 蛋白质工程 (3)农杆菌转化法 植物细胞的全能性真题验收|感悟高考 淬炼考能(对应学生用书第249页)1．(2022·全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是___________________________________________________________________________________________________________。(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是____________________________________20\n_______________________________________________________________。(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有________(答出两点即可)等优点。(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是____________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是____________________________________________________________________________________________________。[解析] (1)人是真核生物，从人的基因组文库中获得的基因A有内含子，而受体细胞大肠杆菌是原核生物，原核生物基因中没有内含子，相应的就没有切除内含子对应的RNA序列的机制，故无法表达出蛋白A。(2)噬菌体是专一性侵染细菌的病毒，以细菌为宿主细胞，而昆虫病毒侵染的是昆虫，以昆虫为宿主细胞。家蚕属于昆虫，故应选用昆虫病毒作为载体。(3)与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养等优点，故要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。(4)检测基因A是否翻译出蛋白A，可用抗原—抗体杂交法。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型细菌的DNA可以使R型细菌发生转化，说明可调控多糖荚膜产生的基因整合到了R型细菌的DNA分子中并成功得以表达。也就是说DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体并进行表达，这就为基因工程理论的建立提供了启示。[答案] (1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A(2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 (3)繁殖快、容易培养 (4)蛋白A的抗体 (5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体2．(2022·全国卷Ⅱ)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_________________________。(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。20\n(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是____________________________________________________________________________________________(答出两点即可)。(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是________________________________________________________________。(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_________________________________________________________________________________。[解析] (1)与老叶相比，嫩叶组织细胞易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。提取RNA时，提取液中添加RNA酶抑制剂可防止RNA被RNA酶催化降解。(2)以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作用下，通过逆转录(反转录)可以获得cDNA。(3)因该目的基因是通过逆转录形成的，无表达所需的启动子，也无在受体细胞内进行复制所需的复制原点等，所以在受体细胞内不能稳定存在和表达，也不能遗传下去。(4)构建基因表达载体时，DNA连接酶能催化目的基因和质粒载体这两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。(5)转基因植株的基因组中含有几丁质酶基因，但该植株抗真菌的能力并没有提高，可能是由于转录或翻译异常，即几丁质酶基因未能正常表达。[答案] (1)嫩叶组织细胞易破碎 防止RNA降解 (2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA (3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子 (4)磷酸二酯键 (5)目的基因的转录或翻译异常3．(2022·全国卷Ⅲ)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。图1图220\n回答下列问题：(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是__________________________。(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________，加入了________作为合成DNA的原料。(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是__________________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是__________________。②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。[解析] (1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则基因表达载体中编码乙的DNA序列起始端无ATG，无论以DNA的哪条链为模板，转录出的mRNA都无起始密码子AUG，使所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙。(2)在PCR技术中，除了引物和耐高温的DNA聚合酶外，还需要序列甲(DNA片段)作为模板，dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)作为原料。(3)①当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，可能是由于发生了接触抑制，可用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞，制成细胞悬液分瓶继续传代培养。动物细胞培养中，CO2的作用是维持培养液的pH。②对照分析图1和图2可知，能刺激T淋巴细胞增殖的甲和乙中都含有C片段，而对T淋巴细胞增殖促进作用很弱的丙中没有C片段，据此可知，若缺少C片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。[答案] (1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子 (2)模板 dNTP (3)①进行细胞传代培养 维持培养液的pH ②C4．(2022·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用Bam20\nHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：【导学号：67110094】(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________；并且________________和________________的细胞也是不能区分的，其原因是______________________________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________。[解析] (1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择；等等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。[答案] (1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞5．(2022·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。20\n图(a)图(b)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_____________________________________________________________________________________________________________。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是___________________________________________________________________________________________________。图(c)(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有______________和______________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。[解析] (1)由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。[答案] (1)Sau3A20\nⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案可酌情给分)(3)E﹒coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶(其他合理答案可酌情给分)6．(2022·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_____________________________________________________________________。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__________________和__________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。[解析] (1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如下图所示：由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。[答案] (1)氨基酸序列(或结构)(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能20\n20
