胚胎工程及生物技术的安全性和伦理问题(建议用时：40分钟)1．亚麻酸(ALA)能够促进卵母细胞体外成熟和囊胚发育。为了给水牛体外胚胎产业化生产中合理使用亚麻酸提供理论依据，科研人员研究了不同浓度的亚麻酸对水牛卵母细胞体外成熟、早期胚胎发育的影响。分析回答：①卵母细胞的收集和体外培养：从屠宰场水牛的卵巢中收集并处理卵母细胞，随机分成5组，分别置于不同浓度亚麻酸的培养液中，在39℃、5%CO2的培养箱中培养22～24h。②卵母细胞成熟判断：在显微镜下观察卵母细胞，判断其是否成熟，统计结果如表1。③体外受精：在受精溶液中进行体外受精后，用显微镜观察判断是否完成受精。④早期胚胎培养：将受精卵移入胚胎培养液中培养44～48h后检查分裂情况，每隔48h更换一次培养液，第5～9天观察囊胚发育情况，统计结果如表2。表1亚麻酸对水牛卵母细胞体外成熟的影响ALA浓度/μmol·L－1卵母细胞数核成熟卵子数02291371020113350227166100215137200215135表2亚麻酸对水牛早期胚胎发育的影响ALA浓度/μmol·L－1培养卵数分裂数囊胚数030917175103251828250292185971003101888420023114568(1)步骤①中，细胞培养箱中加5%CO2的作用是____________________。(2)步骤②中，成熟卵母细胞内染色体的行为特征是______________________________________。步骤③中，判断是否受精的依据是____________________________________________。(3)步骤④中，受精卵经____________(时期)发育成囊胚，培养过程定期更换培养液的目的是________________________________。(4)根据实验数据分析，亚麻酸溶液为200μmol·L－1-8-\n时，对水牛卵母细胞体外成熟和囊胚发育起__________(填“促进”或“抑制”)作用。(5)实验结果表明，____________μmol·L－1的亚麻酸对水牛卵母细胞体外成熟和囊胚发育都较有利，判断依据是____________________________________。[解析] (1)动物细胞培养时，细胞培养箱中加5%CO2的作用是维持培养液pH的相对稳定。(2)卵母细胞培养到减数第二次分裂中期时才成熟，而减数第二次分裂中期的特征是染色体的着丝点排列在赤道板上；判断是否受精的依据是在卵细胞膜和透明带的间隙可否观察到两个极体。(3)早期胚胎发育过程：受精卵→卵裂期→桑椹胚→囊胚→原肠胚，因此步骤④中，具有32个细胞的胚胎发育时期是桑椹胚；培养过程定期更换培养液的目的是清除有害代谢产物，补充营养物质。(4)表格1中亚麻酸溶液为0μmol·L－1的一组为对照组，与其相比，亚麻酸溶液为200μmol·L－1时，核成熟卵子数占卵母细胞的比例较高，囊胚数占培养卵数的比例较高，可见其对水牛卵母细胞体外成熟和囊胚发育起促进作用。(5)表格2中，亚麻酸溶液浓度为50μmol·L－1时，核成熟卵子数占卵母细胞的比例较高，囊胚数占培养卵数的比例较高，因此50μmol·L－1的亚麻酸对水牛卵母细胞体外成熟和囊胚发育都较有利。[答案] (1)维持培养液pH的相对稳定 (2)染色体的着丝点排列在赤道板上 在卵细胞膜和透明带的间隙可否观察到两个极体 (3)桑椹胚 清除有害代谢产物，补充营养物质 (4)促进 (5)50 核成熟卵子数占卵母细胞的比例较高，囊胚数占培养卵数的比例较高2．(2020·深圳市高级中学高三模拟)如图为纯种荷斯坦奶牛的繁殖过程，据图回答下列问题：(1)克隆动物培养过程与图示繁殖过程相比，特有的技术手段是________技术，这两种繁殖动物的方式相比，实质性的区别为前者是________(填“无性生殖”或“有性生殖”)，后者是________(填“无性生殖”或“有性生殖”)。(2)一般用________激素对供体母牛做超数排卵处理。用孕激素处理受体牛以利于胚胎移植。(3)受精卵体外培养所需的培养液成分一般比较复杂，除一些无机盐和有机盐类外，还需要添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸以及________等物质。(4)纯种荷斯坦奶牛繁殖成功原因之一是纯种荷斯坦奶牛胚胎可与受体黄牛的子宫建立________，但是移入受体的供体胚胎的________在孕育过程中不受任何影响。-8-\n(5)某研究所决定培养转基因荷斯坦奶牛，科研人员先构建含药用蛋白基因的表达载体；再将其导入受精卵中；然后还要采用DNA分子杂交技术检测______________________________________________。[解析] (1)培育克隆动物，采用的特有的技术手段是核移植技术，核移植技术为无性生殖。图示繁殖过程采用了体外受精和早期胚胎培养等技术，属于有性生殖。(2)一般使用促性腺激素对供体母牛进行超数排卵处理。(3)受精卵在体外培养所用的发育培养液的成分，除一些无机盐和有机盐类外，还需要添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸以及血清等物质。(4)胚胎移植成功的原因之一是供体胚胎(纯种荷斯坦奶牛的胚胎)可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但是移入受体的供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受任何影响。(5)在基因工程中，常采用DNA分子杂交技术检测转基因荷斯坦奶牛的DNA上是否插入了药用蛋白基因。[答案] (1)核移植 无性生殖 有性生殖 (2)促性腺 (3)血清 (4)正常的生理和组织联系 遗传特性 (5)转基因荷斯坦奶牛的DNA上是否插入了药用蛋白基因3．(2020·湖南师大附中高三月考)“试管婴儿”是通过将不孕夫妇的精子和卵细胞取出在试管中完成受精，并在试管中培养使其发育到一定时期，再将胚胎移入女性子宫内发育成的胎儿。“试管婴儿技术”不仅使一部分不能生育的男女重新获得了生育的机会，也为人类的优生优育开辟了新的途径。(1)在体外受精时，精子首先要进行________处理，卵细胞则要培养到________________________________(时期)才能与精子结合。(2)“试管婴儿”的形成用到的生物技术有________(填序号)。①早期胚胎培养 ②体外受精 ③胚胎移植 ④核移植(3)采用________技术，能得到“同卵双胞胎”，用这种方式诞生的双胞胎，其性别________。这种技术一般采用发育良好、形态正常的________。对胚胎进行分割时，要特别注意将________均等分割，否则会影响分割后的胚胎恢复和进一步发育。(4)试管婴儿技术作为现代生物技术，它和母亲正常怀孕、生产的过程的不同之处是试管婴儿是“体外受精”形成的________，初步发育后再进行“胚胎移植”的产物。(5)现在大多数人反对设计婴儿性别。其原因是可能破坏人类正常的________，违反伦理道德。(6)早期胚胎中的胚胎干细胞，不仅可以应用于哺乳动物胚胎性别鉴定，还可应用于治疗人类的某些疾病，如老年痴呆症、糖尿病等；ES细胞体外诱导分化培育出人造组织器官用于________、研究体外细胞分化等领域。[解析] -8-\n(1)在体外受精时，精子首先要进行获能处理，使精子具备与卵子结合的能力；卵细胞则要培养到减数第二次分裂中期(或MⅡ中期)才能与精子结合。(2)试管婴儿技术主要包括体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植等技术，故选①②③。(3)来自同一个胚胎的后代具有相同的遗传物质，因此采用胚胎分割(移植)技术可获得“同卵双胞胎”。用这种方式诞生的双胞胎，其性别相同。这种技术一般采用发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚。对胚胎进行分割时，要特别注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后的胚胎恢复和进一步发育。(4)试管动物技术是指通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为早期胚胎后，再经移植后产生后代的技术。试管婴儿技术作为现代生物技术，它和母亲正常怀孕、生产的过程的不同之处是：试管婴儿是“体外受精”形成受精卵，且早期胚胎发育在试管中进行，再经过“胚胎移植”得到的产物。(5)如果滥用试管婴儿技术设计婴儿性别，将会破坏人类正常的性别比例，违反了伦理道德。(6)胚胎干细胞的主要用途：①可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律；②是在体外条件下研究细胞分化的理想材料；③可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、糖尿病、老年痴呆症、肝衰竭、心衰竭、成骨不良；④培育各种组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。[答案] (1)获能 减数第二次分裂中期(或MⅡ中期) (2)①②③ (3)胚胎分割(移植) 相同 桑椹胚或囊胚 内细胞团 (4)受精卵 (5)性别比例 (6)器官移植4．(2020·临汾市高三模拟)据报道，科研人员已将POLLED基因的一个等位基因插入到奶牛胚胎成纤维细胞的基因组中。他们随后进行体细胞核移植：将这种经过基因改造的胚胎成纤维细胞移植到移除细胞核的奶牛卵母细胞中，使其重组并能发育为新的胚胎，并将形成的重组胚胎移植到代孕母奶牛子宫中，最终产下5只小牛，其中的两只小牛Spotigy和Buri仍然是活的，如今有10个月大。更重要的是，他们没有发现这些小牛存在角芽的证据。(1)科研人员将POLLED基因的一个等位基因插入到奶牛胚胎成纤维细胞的基因组中的常用方法是____________。(2)为了使POLLED基因的一个等位基因能够表达和发挥作用，就要进行______________的构建。在构建过程中，要用到的两种酶是____________、______________。(3)从屠宰场收集奶牛卵巢，采集卵母细胞，在体外培养到__________期。(4)奶牛一般选取发育到____________阶段的重组胚胎进行移植。移植的胚胎能在代孕奶牛子宫内发育的免疫学基础是______________________。(5)中国荷斯坦牛为我国奶牛的主要品种，它的育种原理是______________。它与该转基因奶牛的培育原理________________________(填“相同”或“不同”)。[解析] (1)迄今为止，显微注射技术是转基因动物中采用最多，也是最为有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。-8-\n(2)基因表达载体的构建是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。在构建过程中，要用到的两种酶是限制酶(限制性核酸内切酶)与DNA连接酶。(3)从屠宰场收集奶牛卵巢，采集卵母细胞，在体外培养到减数第二次分裂中期。(4)不同动物胚胎移植的时间不同，例如，牛、羊一般要培养到桑椹胚或囊胚阶段才进行移植。大量的研究已经证明，受体子宫对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体子宫内的存活提供了可能。(5)我国奶牛的主要品种中国荷斯坦牛(原称中国黑白花牛)，是将国外的荷斯坦——弗里生牛引进后，在我国经过长期驯化，与当地黄牛进行杂交和选育，逐渐形成的优良品种。转基因奶牛的培育原理也是基因重组。[答案] (1)显微注射技术 (2)基因表达载体 限制酶(限制性核酸内切酶) DNA连接酶 (3)减数第二次分裂中 (4)桑椹胚或囊胚 受体子宫对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应 (5)基因重组 相同5．(2020·湖北省襄阳市高三月考)下面是大量获得高产奶牛品种的一些方法：甲方法：通过电刺激使高产雌牛A体细胞的细胞核进入B牛“？”细胞得到重组细胞，试管中培养后得到早期胚胎。乙方法：将高产雌牛的成熟卵子和高产雄牛的“？”一起放在受精溶液中培养得到受精卵，培养后得到早期胚胎。丙方法：将高产基因导入普通奶牛的受精卵，培养后得到早期胚胎。(1)甲方法中“？”代表________，乙方法中“？”代表________。(2)三种方法最终要获得优良后代，都要经过________，它是胚胎工程的最后一道工序。获得的三种后代通常叫作________(请从①“试管牛”②“转基因牛”③“克隆牛”中选择合适的名称按甲乙丙的顺序填数字编号)。(3)生产实践中经常要对获得的早期胚胎进行性别鉴定，通常取囊胚的________来鉴定，上述三种方法中哪种方法得到的胚胎不需要做性别鉴定？________________________________。(4)为了提高胚胎利用率可用________的方法获得两个或者多个一样的胚胎，这可以看作是动物________繁殖的方法之一。[解析] (1)甲中通过核移植获得克隆动物，故应该将高产雌牛A体细胞的细胞核进入B牛去核的MⅡ中期卵母细胞；乙通过体外受精获得胚胎，其中的“？”代表已获能的精子。(2)三种方法获得的早期胚胎都需要经过胚胎移植，移植到同期发情的受体母牛子宫中。甲中获得的后代称为③“克隆牛”；乙中获得的后代称为①“试管牛”；丙中获得的后代称为②“转基因牛”。(3)生产实践中通常取囊胚的滋养层细胞对获得的早期胚胎进行性别鉴定，题目中甲方法是核移植的产物，获得的克隆动物的性别与提供细胞核的个体一致，不需要进行性别鉴定。(4)通过胚胎分割对早期胚胎进行处理，可以提高胚胎利用率，属于无性繁殖。[答案] (1)去核MⅡ中期卵母细胞 获能的精子 (2)胚胎移植 ③①② (3)滋养层细胞 甲 (4)胚胎分割 无性6．性别控制技术在畜牧生产中的应用，充分发挥了受性别限制的生产性状(如泌乳、生长速度、肉质等)的最大经济效益。如图所示，依据X染色体的DNA含量比Y染色体多，用流式细胞仪将牛的两种精子分离开来，再通过试管动物技术获得所需性别的试管牛。回答下列问题。-8-\n(1)将分离出的精子用钙离子载体A23187溶液进行________处理后，才能与培养成熟的卵细胞融合形成受精卵。受精过程中防止多精入卵的生理反应有____________________________________。(2)若培育生产血清白蛋白的乳腺生物反应器，需将血清白蛋白基因与____________________________的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法导入受精卵________(填“甲”或“乙”)中，然后将该受精卵继续培养到______________阶段移入受体，使其生长发育成转基因试管牛。(3)在胚胎移植前，需要用激素对“代孕母体”作________________处理。由于受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生__________________，从而保证胚胎能在受体内存活。(4)用Y染色体上决定性别的SRY基因探针对滋养层细胞的DNA进行检测，可达到鉴定胚胎性别的目的，这种检测方法采用的是__________________________技术。[解析] (1)将分离出的精子用钙离子载体A23187溶液进行获能处理后，才能与培养成熟的卵细胞融合形成受精卵。受精过程中防止多精入卵的两道屏障是透明带反应和卵细胞膜反应。(2)若培育生产血清白蛋白的乳腺生物反应器，需将血清白蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射等方法导入到雌性牛即受精卵甲中，然后将该受精卵继续培养到桑椹胚或囊胚阶段移入受体，使其生长发育成转基因试管牛。(3)在胚胎移植前，需要用激素对“代孕母体”作同期发情处理。由于受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应，从而保证胚胎能在受体内存活。(4)用Y染色体上决定性别的SRY基因探针对滋养层细胞的DNA进行检测，可达到鉴定胚胎性别的目的，这种检测方法采用的是DNA分子杂交技术。[答案] (1)获能 透明带反应、卵细胞膜反应 (2)乳腺蛋白基因 甲 桑椹胚或囊胚 (3)同期发情 免疫排斥反应 (4)DNA分子杂交7．(2020·河北省衡水中学高三检测)研究人员将绵羊的启动子和牛的生长激素基因融合，获得融合基因OMT－CGH(其中O、C分别表示绵羊和牛，MT表示启动子，GH表示生长激素基因)，并将其转移至某种牛的体内，从而培育出能快速生长的转基因牛。请回答下列问题：(1)在生长激素基因与启动子融合的过程中，需要用到的工具酶有____________。-8-\n(2)目前，将OMT－CGH基因导入受体细胞的方法有________和精子载体法等，其中后者的做法是向去精浆的精液中加入适量OMT－CGH基因，精子主动吸收外源基因后，再与成熟卵子进行体外受精，获得受精卵。由此可见，与前者相比，该方法对受精卵内细胞核的影响________(填“大”或“小”)，理由是________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)早期胚胎在培养时除了必需的营养物质外，还需要的气体环境是________，在培养过程中，应及时更换培养液，目的是_______________________________________________________________________________________。(4)常采用PCR技术检测早期胚胎是否含有OMT－CGH基因，该技术使用的前提是要根据________(填“OMT”“CGH”或“OMT－CGH”)的基因序列设计合成引物。[解析] (1)在生长激素基因与启动子融合的过程中，需要用到的工具酶是DNA连接酶。(2)目前，将OMT－CGH基因导入牛体内的方法有显微注射法和精子载体法等；精子载体法对受精卵内细胞核的影响更小；精子载体法不需要借助人工显微操作，直接向去精浆的精液中加入适量OMT－CGH基因，精子主动吸收外源目的基因后，再与成熟卵子进行体外受精，获得受精卵，此方法能避免显微注射对细胞核等结构造成损伤。(3)早期胚胎在培养时除了必需的营养物质外，还需要95%的空气和5%的CO2的气体环境；为防止代谢产物对细胞造成危害，需要定期更换培养液。(4)PCR技术可确定早期胚胎是否含有OMT－CGH基因，该技术使用的前提是要根据OMT－CGH的基因序列设计合成引物。[答案] (1)DNA连接酶(或限制性核酸内切酶、DNA连接酶) (2)显微注射法 小 目的基因由精子细胞核携带通过受精作用进入细胞核，避免显微注射对细胞核等结构造成损伤 (3)95%的空气和5%的CO2 防止代谢产物的积累对细胞自身造成危害 (4)OMT－CGH8．中国科学院上海神经科学研究所仇子龙研究员等通过构建携带人类自闭症基因MECP2的转基因猴模型及对MECP2转基因猴进行分子遗传学与行为学分析，发现MECP2转基因猴表现出类似人类自闭症的刻板行为与社交障碍等行为。在该研究中，研究人员先通过精巢异种移植，将幼年食蟹猴的精巢移植到裸鼠的背部，实现了食蟹猴精巢提早成熟，从中获得精子，让其完成受精作用，并进一步培养，操作过程如图，从而获得了携带人类自闭症基因MECP2的转基因猴(Z症食蟹猴)。该工作加速了食蟹猴的精子生成速度，缩短了食蟹猴的繁殖周期，对于推动非人灵长类动物模型的应用具有重大意义。回答下列问题：(1)图中将精子注入________细胞，该细胞处于________期。(2)将CRISPR/Cas9基因编辑系统注入受精卵后，Cas9蛋白能在特定部位切割MECP2基因(如图虚线所示)，使该基因特定部位的两个核苷酸之间的________断开，经其切割后产生具有________末端的DNA片段。-8-\n(3)乙过程对受精卵的培养是在________中进行的，丙表示的过程是________。(4)上述获得的Z症食蟹猴，可通过体细胞核移植技术进一步得到克隆Z症食蟹猴。该技术的原理是__________________。所得到的克隆Z症食蟹猴的性状表现为____________________。[解析] (1)受精时所用的卵母细胞是处于减数第二次分裂中期(MⅡ中期)的次级卵母细胞。(2)结合题中信息分析，Cas9蛋白能在特定部位切割MECP2基因，推测Cas9蛋白为限制酶，由图示可知该基因特定部位断开的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键，经其切割后产生的DNA片段具有平末端。(3)乙过程为早期胚胎培养的过程，受精卵在发育培养液中培养为早期胚胎。丙表示的过程是胚胎移植。(4)利用以上技术获得的Z症食蟹猴，可通过体细胞核移植技术得到克隆Z症食蟹猴，该技术利用的原理是动物细胞核具有全能性。克隆Z症食蟹猴的性状中，绝大多数性状与Z症食蟹猴相同，少数性状与受体的性状相同。[答案] (1)次级卵母 减数第二次分裂中 (2)磷酸二酯键 平 (3)发育培养液 胚胎移植 (4)动物细胞核具有全能性 绝大多数性状与Z症食蟹猴相同，少数性状与受体的性状相同-8-
